Лимфоциты выделяют из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина в течение 45 мин при 400 g (Bouym A., 1968). Принципданногометода – различнаяскоростьоседанияклетоквградиентеплотности, взависимостиотихудельнойплотности. Длявыделениялимфоцитовиспользуютсмесь, состоящуюиз 12 частей 9% фиколлаи 5 частей 33,9% верографина, имеющуюплотность 1,077. Цельнуюкровь, нанесеннуюнаэтусмесь, центрифугируют, иклеткисразличнойудельнойплотностьюразделяются. Лимфоцитыимоноцитыостаютсянаградиентеплотности, таккакимеютплотность 1,077, аэритроцитыигранулоцитыоседаютнаднопробирки (рис. 25).
Соотношениеобъемовградиентаиразделяемойсуспензиидолжнобыть 1:2–1:5. Интерфазныйслойотсасывают, добавляютфизиологическуюсредуиотмываютвыделенныемононуклеары (3 раза).
В настоящее время самым точным и высокотехничным методом определения фенотипа иммунокомпетентных клеток является лазерная проточная цитометрия, по
Рис. 25. Разделение клеток после центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина |
|
|
Антиглобулиновое антитело |
МКАТ |
ФИТЦ |
Рис. 26. Схема специфического связывания клетки с МКАТ и окрашивания антителами, меченными ФИТЦ |
|
|
Фенотип лимфоцитов можно определять и с помощью люминесцентной микроскопии. Под микроскопом клетки, связавшие соответствующие МКАТ и антиглобулиновые антитела, меченные ФИТЦ, имеют специфическое свечение.
Рис. 27. Схема проточной лазерной цитометрии
В настоящее время с помощью МКАТ идентифицирован ряд поверхностных антигенов лейкоцитов, обозначаемых, как известно, буквами CD (от «кластер дифференциации») и соответствующим номером. В табл. 10 приведена характеристика ряда значимых для клинической иммунологии антигенов.
Таблица 10
Характеристика CD-антигенов
CD-антиген | Молекулярная масса, Кд | Экспрессия | Функции |
CD3 | 20-28 | Тимоциты Т-клетки | Все периферические Т-клетки экспрессируют. СD3 – это TCR-ассоциирован-ный комплекс, участвующий в передаче сигнала в клетке. СD3 является маркером Т-клеток |
CD4 | 55 | Субпопуляция Т-клеток (Т-хелперы), распознающая антигены, ассоциированные с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса | Лиганды: молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса. Регуляция внутритимической дифференцировки, Т-В-клеточной адгезии, корецептор в Т-клеточной активации |
Окончание табл. 10
CD-антиген | Молекулярная масса, Кд | Экспрессия | Функции |
CD8 | 32-34 | Большинство тимоцитов, 30% Т-клеток в ПК и субпопуляция NK-клеток | Лиганды: молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса. Регуляция внутритимической дифференцировки, Т-В-клеточной адгезии, корецептор в Т-клеточной активации. Маркер цитотоксических Т-клеток |
CD16 | 50-80 | Большие гранулярные лимфобласты, NK-клетки, нейтрофилы | Низкоаффинный рецептор агрегированного IgG (FcγRΙΙΙ) |
CD20 | 33-37 | Антиген, специфический для В-клеток, клетки со стадии пре-В-клеток до В-бластов | Активация В-клеток, возможно, является компонентом Ca++ каналов |