Микроскопическое исследование исходного материала
Объектом исследования является гной, экссудат, содержимое абсцессов, пораженные лимфатические узлы. Тканевый материал в случае необходимости консервируют в 30%-ном водном растворе глицерина.
Бактериологическое исследование
При диагностике болезней, вызываемых A.bovis и A.viscosus, существенное диагностическое значение имеет микроскопия зернистых гранул «друз», обнаруживаемых в гное или экссудате. С указанной целью гной (экссудат) помещают в чашку Петри, разводят небольшим количеством дистиллированной воды, находят зеленовато-желтые (A.bovis) или серо-белые (A.viscosus) зернышки, т.н. «друзы». Зернышки промывают в дистиллированной воде, помещают на предметное стекло в каплю 10-20%-ного раствора NaOH или КОН и выдерживают 15 минут или немного подогревают над пламенем горелки. Далее на препарат наносят водный раствор глицерина (50%-ный), накрывают его покровным стеклом и изучают под малым и большим увеличением микроскопа. Скопления клеток возбудителя имеют гомогенный центр из переплетенных палочковидных клеток, к периферии булавовидно утолщающихся. При окраске по Граму центр «друзы» окрашивается грамположительно, периферия — грамотрицателыю.
|
|
В препаратах, содержащих в материале A.pyogenes, находят маленькие, очень полиморфные грамположительные палочковидные бактерии размером 0,5-2,0 х 0,2-0,3 мкм, располагающиеся беспорядочно. Клетки A.hordieovulneris имеют морфологию, типичную для рода, — нитевидные ветвящиеся, реже короткие дифтероидные формы.
Культивирование. Посев исследуемого материала производят на кровяной агар (кровь овец, крупного рогатого скота). Посевы материала, предположительно содержащего A.bovis, культивируют в аэробных условиях в атмосфере 10%) СО2; A.hordeovulneris растет в аэробных и анаэробных условиях с содержанием в атмосфере 10%> CO2 A.pyogenes и
A. Viscosus растут в аэробных условиях с 10%) СО2. Контаминированный материал высевают на селективные среды (см. «Питательные среды»). Для выделения A.israelii из контаминированного материала на неселективных средах следующую его предварительную обработку. Материал суспендируют в транспортной среде Syed: раствор 1-0,6% раствор К2НР04, раствор 2-1,2% раствор NaCl, 1,2% раствор (NH4) 2S04, 0,6% раствор КН2Р04, 0,25% раствор MgS04. Готовая среда содержит 75 мл раствора №1, 75 мл раствора № 2,10 мл 1М раствора этилендиаминотетраацетата, 20 мл свежего 1%-ного раствора дитиотреитола, 5 мл 8%-ного раствора Na2C03, 1 мл 1%>-ного раствора резазурина, 814 мл дистиллированной воды, рН 8,0. Среду стерилизуют фильтрацией. Исследуемый материал суспендируют в транспортной среде. 1 мл суспензии смешивают с 1 мл толуола и встряхивают 20 минут. Водную фазу отсасывают пипеткой, добавляют к ней 10 мл транспортной среды, центрифугируют и осадок высевают на неселективные питательные среды.
|
|
Эффект обработки основан на ингибирующем действии толуола на грамотрицательные бактерии. Посевы культивируют при 36-37° С от 2-4 до 14 дней.
Особенности роста актииомицетов на питательных средах. A.bovis на плотных питательных средах образует нитевидные микроколонии через 24 часа; позднее — макроколонии диаметром около 2 мм, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые или гладкие, без зоны гемолиза, мягкой консистенции. Рост медленный, типичные колонии формируются к 14-15 дню культивирования. Возбудитель хорошо растет (диффузно) в тиогликолатном бульоне к 7-10 дню инкубирования.
A.pyogenes. Нитевидных микроколоний не образует, через 48 часов инкубирования формирует колонии размером около 1 мм с узкой зоной
β-гемолиза, выпуклые, с ровными краями, непрозрачные, белые или серо-белые, гладкие, мягкой консистенции.
A. viscosus формирует колонии двух типов: 1-й тип — крупные, гладкие, блестящие, выпуклые; 2-й тип — маленькие, шероховатые, неправильной формы.
A.hordeovulneris. Первоначально образует нитевидные микроколонии, позднее (14 дней культивирования) формируются колонии размером около 2 мм, приподнятые, с волнистым краем, с нитевидными отростками, непрозрачные, белые, серо-белые, кремово-белые, шероховатые, сухие или мягкой консистенции, обычно без зоны гемолиза.
A.suis. Образует колонии размером до 2 мм, гладкие, непрозрачные, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнистые с отростками, белого или серо-белого цвета. Колонии могут быть шероховатыми или гладкими, сухими или мягкими.
A.israelii. Образует нитевидные микроколонии на плотных средах, к 14 дню - макроколонии R- формы, диаметром около 2 мм, выпуклые, центр может иметь углубление, края волнообразные и нитевидные, непрозрачные, белого, серо-белого, кремово-белого цвета, по консистенции сухие, крошкообразные или мягкие.
Морфология клеток актиномицетов в культуре. Морфология клеток в культуре у ряда актиномицетов отличается от таковой в исследуемом материале.
A bovis. В препаратах, окрашенных по Граму, клетки имеют форму грамположительных палочек, коккобактерий, палочек с утолщенными или разветвляющимися концами, могут присутствовать нити различной длины.
A.pyogenes. В препаратах находят типичные для рода полиморфные грамположительные палочки.
A. viscosus. В мазках из крупных колоний обнаруживают грамположи-тельные дифтероидные палочковидные клетки, в мелких колониях — короткие ветвящиеся нити.
A hordeovulneris. Морфология клеток в препаратах типична для рода. A.suis. В препаратах находят типичные грамположительные палочки дифтероидной формы, иногда кокковидной, а также V, Y или Т-формы, короткие или длинные нити, ветвящиеся формы.
Идентификация представителей рода Actinomyces на уровне рода. Начальные этапы идентификации предполагают в первую очередь дифференциацию видов рода Actinomyces от родов Nocardia, Streptomyces, Dermatophilus. При этом у выделенных культур определяют: потребность в О каталазную активность, подвижность, кислотоустойчивость клеток, рост на грибных средах, наличие воздушных гиф, образование спор, фрагментацию гиф наличие запаха у колоний, тип утилизации углеводов (оксидация, ферментация в тесте Хью - Ляйфсона).
На основании перечисленных признаков для дальнейшего изучения отбирают культуры бактерий, типичные по морфологическим, тинкториаль-ным и культуральным свойствам для Actinomyces, растущие в анаэробных или капнофильных (СО2) условиях атмосферы, не имеющие запаха, дающие отрицательную (чаще) или положительную (реже) реакцию на каталазу, не проявляющие при окраске по модифицированному методу Циля — Нильсена кислотоустойчивое™, не растущие на средах для культивирования гри бов, не образующие воздушных гиф, спор, не проявляющие склонности к фрагментации нитей (гиф), расщепляющие углеводы (глюкоза) в тесте Хью — Ляйфсона путем ферментации.
|
|