Возбудитель паратуберкулеза

Среда Дюбо - Смита (в модификации А. П. Аликаевой). Состав: одно­замещенный фосфат калия 1 Г, двузамещенный фосфат натрия 6,25 г, сульфат магния 0,01 г, хлорид кальция 0,0005 г, сульфат цинка 0,0001 г, сульфат меди 0,0001 г, цитрат аммиак-железа 0,05 г. I-аспарагин 1 г, гидролизат казеина 80 мл, спиртовый экстракт из микобактерий флеи 20 мл.

Приготовление солевых компонентов. Навески однозамещенного фосфата калия, двузамещенного фосфата натрия, сульфата магния растворяют в 200 мл свежекипяченой дистиллированной воды в колбе на 1 л. В другой колбе в таком же объеме дистиллированной воды при подогреве поочередно растворяют аспарагин и цитрат аммиак-железа. Оба раствора смешивают и добавляют по 1 мл 0,05%-ного раствора хлорида кальция и 0,01%-ных растворов сульфата цинка и сульфата меди. Их дозируют следующим образом.

На аналитических весах отвешивают 50 мг хлорида кальция и по 10 мг сульфата меди и сульфата цинка. Навески растворяют в отдельных пробирках в 1О мл дистиллированной воды. 1 мл каждого раствора разводят в 9 мл ди­стиллированной воды и получают растворы нужных концентраций.

К смеси солевых растворов добавляют гидролизат казеина и экстракт мико­бактерии флеи, перемешивают, доводят объем до 1 л дистиллированной водой вновь перемешивают и пропускают через бумажный фильтр. Устанавливают рН 6,5 концентрированной соляной кислотой (около 1 мл на 1 л), добавляют 15 г хорошо промытого агар-агара (лучше агар Дифко), расплавляют при подогре­ве, разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют при 1 ати 20 мин.

Перед употреблением агар (100 мл) расплавляют, охлаждают до 50⁰Си асептически добавляют 20% стерильной бычьей сыворотки, прогретой при 50⁰Св течение 1 ч и 0,6 мл раствора пенициллина, содержащее 10 000 ЕД/мл (ко­нечная концентрация пенициллина в среде 50 Ед/мл). Среду перемешивают, разливают в пробирки и скашивают. Через сутки пробирки ставят в термостат на 48 ч для проверки на стерильность. Употребляют в свежем виде при наличии конденсата.

Приготовление гидролизата казеина. В 1 л водопроводной воды при 28⁰Сдобавляют 84 г сухого казеина. Устанавливают 10%-ным раствором едкого ка­лия рН 8,0, выдерживают в водяной бане при 28⁰С 3 ч и вновь устанавливают рН 8,0. Добавляют 2 мл панкреатина и 25 мл хлороформа, плотно закрывают резиновой пробкой и выдерживают при комнатной температуре 10 дней. Про­цеживают через полотно, устанавливают рН 7,4, разливают в колбы и стерили­зуют при 1 ати 30 мин. Может сохраняться длительно при комнатной темпе­ратуре.

Приготовление спиртового экстракта из микобактерий флеи по Смиту. Куль­туру М.phile выращивают в МПБ с 4% пептона и 10% глицерина 3-4 недели. Микробную мaсcy осаждают на двойном бумажном фильтре в воронке Бюхнера, соединенной с колбой Бунзена. Осаждение ведут при небольшом вакууме (650-700 мм ртутного столба), затем фильтр с осадком, не вынимая из ворон­ки, отжимают и прогревают в аппарате Коха при 80⁰С 30 мин. Микробную массу с фильтром кладут в чашку Петри и сушат в эксикаторе на концентри­рованной серной кислотой, снимают с фильтра и растирают в ступке в тонкий порошок. 20 г порошка заливают в колбе 150 мл этилового спирта и кипятят с обратным холодильником 20 мин. Экстракт сливают и экстрагирование дваж­ды повторяют в том же порядке. Собранный экстракт пропускают через бу­мажный фильтр, помещают в эксикатор и сгущают в вакууме до образования вязкой красновато-оранжевой жидкости. Затем ее замешивают в равных объемах с 50%-ным водным раствором нейтрального глицерина устанавливают рН 7,6 и подогревают в водяной бане при 100⁰С 10 мин. В горячем виде вливают в дли­тельную воронку и оставляют до утра. Светлую жидкость, без верхнего слоя жироподобных веществ, собирают, устанавливают рН 7,0, расфасовывают и сте­рилизуют при 1 ати 20 мин. В плотно закрытой посуде экстракт, можно хранить длительно.