А Программа. 1. Возможности методов серодиагностики при оценке гуморального иммунного ответа

1. Возможности методов серодиагностики при оценке гуморального иммунного ответа.

2. Методы выявления иммунных комплексов.

3. Кожно-аллергические пробы для оценки клеточного

иммунитета и реакции гиперчувствительности замед­ленного типа.

4. Методы выявления специфической сенсибилизации Т-лимфоцитов.

5. Получение и применение вакцин, анатоксинов.

6. Получение и применение иммунных сывороток и им­муноглобулинов.

▲ Демонстрация

1. Результаты теста торможения миграции лейкоцитов крови в присутствии причинного антигена.

2. Набор ампулированных препаратов инфекционных аллергенов, вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, диагностикумов.

▲ Задание студентам

1. Протоколировать и оценить результаты развернутых ре­акций агглютинации, поставленных с парными сыво­ротками крови человека, иммунизированного бактери­альной вакциной. Оценить эффективность вакцинации.

2. Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленных с парными сыворотками крови человека, им­мунизированного вирусной вакциной. Оценить эф­фективность вакцинации.

3. Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленной с сывороткой крови больного с бактериальной инфекцией для дифференциации первичной инфек­ции и рецидива.

л Методические указания

1. Реакция торможения миграции лейкоцитов. В основе дан­
ного метода лежит способность лимфоцитов после повтор­
ного контакта с антигеном, к которому они были ранее
сенсибилизированы, продуцировать различные лимфоки-
н ы, в том числе влияющие на миграцию индикаторных кле­
ток (гранулоциты, моноциты, макрофаги). Реакция торможе­
ния миграции лейкоцитов (РТМЛ) периферической крови в
присутствии причинного антигена позволяет выявить специ­
фическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка­
пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко­
цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик­
робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про­
центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем,
принятым за 100 %.

В случае выявления сенсибилизации к антигену на­блюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже

2. Постановка и оценка кожно-аллергической пробы. Для вы­
явления специфической сенсибилизации (при туберкулезе,

бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожно-аллергические пробы. Например, при постановке про­бы Манту внутрикожно вводят раствор туберкулина опреде­ленной концентрации. Реакцию учитывают через 24—48 ч, оценивая степень выраженности гиперемии и инфильтрат вокруг места введения (рис. 10.4.1; на вклейке). В основе положительной кожной пробы лежит клеточная реакция гиперчувствительности замедленного типа, которая отражает специфическую сенсибилизацию организма к данно­му инфекционному аллергену. Она возникает в результате те­кущего, перенесенного заболевания, вакцинации или инфици­рования организма.

3. Выявление нарастания титра антител в серологических ре­акциях с парными сыворотками больного или вакцинированного. Показателем развития гуморального иммунного ответа являет­ся нарастание титра специфических антител в сыво­ротке крови в течение 3—4 нед после инфицирования или вакцинирования. Это устанавливается в реакции с парными сыворотками, т.е. сыворотками, полученными от одного и того же человека в динамике инфекционного или вакцинального про­цесса (например, на 1-й и 3—4-й неделе). Появление антител в сыворотке человека, у которого ранее этих антител не было, называется сероконверсией. Диагностическое значение прида­ется, как правило, 4-кратному и более увеличению титра анти­тел.

При бактериальных инфекциях или вакцинации бактери­альными вакцинами с парными сыворотками ставят реакции агглютинации, РИГА или РСК (табл. 10.4.1).

Таблица 10.4.1. Результаты развернутой реакции агглютинации с бак­териальным диагностикумом и парными сыворотками человека, вакци­нированного бактериальной вакциной

Сроки взятия	Разведения сыворотки	Конт­роль сы­воротки	Конт­роль диа­гноста-кума
	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800
До вакцинации Через 3 нед после вакцинации	+++ — — — — +++ +++++— —	—

Таблица 10.4.2. Результаты РСК с диагностикумом вируса гриппа (эпидемический штамм) и парными сыворотками человека, обследован­ного в период эпидемии гриппа

Сроки взятия крови

Конт­роль сы­воротки

Конт­роль диа-гности-кума

Разведения сыворотки

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

В самом начале + + — — — — —

эпидемии

Через месяц после + + + + — — —

начала эпидемии

4. Постановка РСК с целью дифференцирования IgM и IgG.

Серологические реакции могут быть использованы для ориен­тировочного определения принадлежности специфических ан­тител к одному из двух основных изотипов иммуноглобулинов IgM или IgG. Возможность дифференцировать эти два изотипа иммуноглобулинов основана на их различной чувствительнос­ти к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина и других редуци­рующих веществ, которые вызывают разрывы дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные антительной активности. Под действием той же концентрации 2-меркаптоэтанола молекулы IgG сохраняют свою целостность и антительную активность. Исходя из этого ставят серологи­ческую реакцию (РСК или РТГА) с испытуемой сывороткой: нативной и обработанной 2-меркаптоэтанолом (табл. 10.4.3).

Таблица 10.4.3. Результаты РСК с сывороткой больного, обработан­ной 2-меркаптоэтанолом (2МЕ), для определения принадлежности анти­тел к IgG или IgM изотипу иммуноглобулинов

Исследуе-			Разведения сыворотки
ротка	1:100	1:200	1:300	1:400	1:500	1:600	1:700	1:800	1:1000
После об­работки 2МЕ Без обра­ботки 2МЕ	+ +	+ +	+ + + + + +	+	+

При вирусных инфекциях или вакцинации вирусными вак­цинами с парными сыворотками ставят РСК, PTIA и реакцию нейтрализации вирусов (табл. 10.4.2).

Нарастание титра антитоксических антител контролируют с помощью реакции флоккуляции или нейтрализации токсина.

При первичной инфекции гуморальный ответ начинается с синтеза IgM, а при рецидиве инфекции на повторную встречу с тем же антигеном иммунная система отвечает преимущест­венным синтезом IgG.

Снижение титра специфических антител в исследуемой сы-

воротке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетель­ствует в пользу первичной инфекции.

Для определения принадлежности специфических антител к определенному классу (изотипу) иммуноглобулинов исполь­зуют также твердофазный иммуноферментный метод. Специ­фический антиген фиксируется на поверхности лунок планше­тов из полистирола и инкубируется с исследуемой сывороткой. После отмывания от несвязанных иммобилизованным антиге­ном белков сыворотки связанные антитела-иммуноглобулины идентифицируются с помощью антиизотипической антиглобу-линовой сыворотки или соответствующих МКАТ. Их связыва­ние в свою очередь устанавливается с помощью антииммуно-глобулиновой сыворотки с ковалентно прикрепленным фер­ментом.