Иммуноферментный анализ (elise –метод)

Врачей интересуют достаточно простые в мето­дическом исполнении и, в то же время, высокочув­ствительные и специфичные методы, использова­ние которых возможно не только в лабораториях, но и в условиях кабинета, где непосредственно проводится прием больных, в приемных отделени­ях, а также вне медицинского учреждения (при вызове на дом или предприятие).

К одному из таких методов вполне можно от­нести иммуноферментный анализ (ИФА). Методы иммуноферментного анализа посто­янно совершенствуются фирмами-производите­лями: повышается чувствительность и специфич­ность тест-систем, подбираются наиболее удоб­ные условия для работы, сокращается число этапов проведения исследования, что способст­вует уменьшению возможности совершения оши­бочных действий.

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция взаимодействия антигена с антителом. Для выявления образовавшихся им­мунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент, которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуали­зация присутствия вещества, определяемого мето­дом ИФА, достигается применением посредника - хромогена. Это особое химическое соединение, хорошо растворимое в воде, раствор которого бес­цветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под дейст­вием фермента, для которого хромоген является субстратом. Слова «хромоген» и «хромофор» в переводе с греческого означают «производящий цвет» и «несущий цвет», соответственно.

В другом варианте ИФА хромоген окисляется продуктом реакции, которую катализирует фер­ментная метка. Окисленное соединение приобре­тает цветную окраску. В зависимости от модифи­кации иммуноферментного анализа хромофор либо остается в растворе, либо выпадает в осадок.

Меченный ферментом специфический компо­нент в конце проведения иммунной реакции на­ходится в двух состояниях: связанном (в составе комплекса (антиген-антитело) и свободном (не вступивший в реакцию его избыток). Количество образовавшихся комплексов (антиген-антитело), а тем самым и содержание определяемого веще­ства, оценивают по каталитической активности ферментной метки.

Перед проведением ферментативной реакции необходимо разделить свободную и связанную фракции ферментной метки. С этой целью при­меняют иммуносорбент, состоящий из двух свя­занных между собой особым образом компонен­тов: специфического реагента, выполняющего роль «ловушки», и нерастворимого вещества, ко­торое именуется термином «твердая фаза», и на поверхности которого образуются иммунные комплексы. Возможны два варианта схем проведения ИФА, демонстрирую­щих разделяющую роль иммуносорбента.

В первом варианте (конкурентном методе) специфический иммунный комплекс, включаю­щий определяемое вещество, образуется сразу непосредственно на твердой фазе, так как узнаю­щий реагент входит в состав иммуносорбента.

Во втором варианте (методе двойного связы­вания) присутствует определенная двухэтапность. Вначале в жидкой фазе произойдет соеди­нение определяемого вещества с узнающим ре­агентом, а затем полученный комплекс будет извлечен из раствора в результате связывания иммуносорбентом. Такая последовательность со­бытий обусловлена тем, что вероятность контак­та молекул в растворе выше, чем на границе твердой и жидкой сред.

Кроме специфического реагента, сорбирован­ного на твердой фазе, все остальные компонен­ты, используемые на всех этапах иммуноферментного анализа и привносимые последователь­но на твердую фазу, в том числе исследуемый образец (сыворотка), находятся в растворенном виде, то есть в жидкой фазе. Основой жидкой фазы является раствор солей, имеющий определенную ионную силу и обладающий буферными свойствами. Он способен поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода (pH), оптимальную для проведения иммунной или ферментативной реакции.

После образования на твердой фазе специфического комлекса (антиген-антитело) жидкая фаза удаляется. Вместе с другими веществами и реагентами, содержащимися в растворе, удаляется и не вступивший в специфическую связь реагент, меченый ферментом. В итоге на твердой фазе остается только ферментная метка, входящая в состав комплекса (антиген-антитело).

С внесением на твердую фазу хромоген-субстратного раствора начинается ферментативная реакция.

ИФА позволяет выявить титр специфических антител (иммуноглобулины классов M, G, A) в сыворотке крови пациента. Положительным является объективный учет реакции с помощью спектрофотометра. Длительность реакции около пяти часов. Не исключены перекрестные реакции.