1. Приготовление раствора крахмала с массовой долей 1% (субстрата).
(1,00 + 0,01) г крахмала, взятого с учетом влажности, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 см3 воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 см3 воды, помещают колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10-15 мин, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают. Раствор должен быть прозрачным.
Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.
2. Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 6,0.
Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия концентрацией 1/15 моль/дм3 в соотношении 1:9.
Величину рН проверяют на прибор. В случае отклонения рН буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы.
3. Приготовление основного раствора йода.
0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды.
|
|
Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюкса.
Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 см3 и объем доводят дистиллированной водой до метки.
Основной раствор йода хранят в течение 1 мес. в склянке из темного стекла с притертой пробкой.
4. Приготовление рабочего раствора йода.
2 см3 основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/дм3 при анализе препаратов бактериального происхождения с предполагаемой активностью больше 50 ед/см3 в мерной колбе вместимостью 100 см3. Перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне длин волн 440 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна 0,220 (+ 0,01).
В случае отклонения ее от этого значения добавляют в раствор несколько капель соляной кислоты или основного раствора йода.
5. Приготовление основного раствора из культуральной жидкости бактериального происхождения.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 наливают 90 см3 дистиллированной воды и вносят 1 см3 испытуемой культуральной жидкости. Объем доводят до метки дистиллированной водой.
6. Приготовление рабочего раствора из культуральной жидкости.
Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 см3 в соответствии с таблицей.
Таблица
Амилолитическая активность (АС) культуральной жидкости, ед/см3 (предполагаемая) | Масса (m1) культуральной жидкости в 5 см3 рабочего раствора, г | Объем основного раствора, необходимый для вторичного разбавления, см3 |
От 10 до 25 включ. | 0,01 | 20,0 |
-//- 25 -//- 50 -//- | 0,005 | 10,0 |
-//- 50 -//- 75 -//- | 0,003-0,0035 | 6,0-7,0 |
-//- 75 -//- 100 -//- | 0,0025 | 5,0 |
-//- 100 -//- 125 -//- | 0,0020 | 4,0 |
-//- 125 -//- 150 -//- | 0,0015 | 3,0 |
-//- 150 -//- 180 -//- | 0,00125 | 2,5 |
-//- 180 -//- 200 -//- | 0,00075 | 1,5 |
-//- 200 -//- 300 -//- | 0,0005 | 1,0 |
-//- 300 -//- 450 -//- | 0,00025 | 0,5 |
Примечание. При анализе культур бактериального происхождения с предполагаемой активностью
|
|
50-150 ед/см3 берут разведение фермента, обеспечивающее гидролиз крахмала от 0,02 до 0,04 г.