Проведение анализа

Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 см³ раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню с температурой (30 + 0,2)⁰С на 5-10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 см³ дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую 5 см³ рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате в течение 10 минут, используя секундомер.

Затем из каждой пробирки поочередно отбирают по 0,05 см³ раствора и переносят в пробирки с предварительно налитыми 5 см³ рабочего раствора йода. Содержимое пробирок перемешивают. Полученные растворы приобретают следующую окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала.

Через 5-10 мин. после смешивания определяют оптическую плотность растворов спектрофотометром в диапазоне длин волн 670 нм в кюветах толщиной 1 см. Контрольным раствором при измерении является дистиллированная вода.

Обработка результатов.

Массу прогидролизованного крахмала (m) в г вычисляют по формуле:

D₁ - D₂

m= ----------- x 0,1,

D₂

где D₁ - оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ - оптическая плотность опытного раствора;

0,1 - масса крахмала, взятая для анализа, г.

Если масса прогидролизованного крахмала меньше 0,02 или больше 0,06 г, то анализ повторяют, подбирая другое разведение.

Амилолитическую активность (АС) в ед/г для препаратов бактериального происхождения и в ед/см³ для культуральной жидкости вычисляют по формуле:

5,885m + 0,001671

АС= ----------------------------- (ед/см³)

m₁

где m₁ - масса ферментного препарата, содержащегося в 5 см³ рабочего раствора, г (см. таблицу);

5,885 и 0,001671 -коэффициенты расчетного уравнения, полученные при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизованного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 час действия фермента.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 3%. Результат округляют до первого десятичного знака.