Софокусный Анализ

Последовательные серии срезов были подготовлены согласно обычной процедуре к гистологической для иммунофлуоресцентной оценки, включая керосиновое включение и шаги депарафинизации, для обеспечения 5  μ м.толщины срезов. Слайды были обработаны (3%-ый бычий сывороточный альбумин и Тритон на 0.5 % X-100 в 10 mM в буферизированном солончаке фосфата, pH фактор 7.5; PBC и затем быстро выведенный в 4°C с коктейлем следующих антител: античеловеческих- кролика к TLR4 (4  μ г/мл) и античеловеческих- козьих антител к TLR9 (2  μ г/мл), купленный от Биотехнологии Санта-Круза (Санта-Круз, Калифорния). Специфическое связывание первичных антител был обнаружено, используя вторичное определение для разновидностей Cy32-спрягаемого антикроличьих (для TLR4) и Cy3-спрягаемая антикозьих (для TLR9), все предварительно обрабатывали 1/200 в ЗИС содержащей Tween-20 0.05 % раствор, и выводили в комнатной температуре в течение 45 минут (Jackson Лаборатории ImmunoResearch, Западная Роща, Пенсильвания). Isotype-соответствовавшие антитела Г иммуноглобулина (управляют isotype, Векторными Лабораториями, Burlingame, Калифорнией, США) были выведены параллельно, и разделы использовались для приобретений ряда канала. Источником света был лазер на основе ионов аргона (25 mW) предоставление длины волны возбуждения в 458-584 nm области(регионе). FITC был взволнован 488 nm. Cy3 был взволнован 550 nm. Цифровые изображения единственных(отдельных) оптических разделов были приобретены, используя ×60/oil-immersion, цель использовать E2000U инвертировала софокусный микроскоп (Nikon, Токио, Япония); размеры изображения были 512 × 512. Отрицательные скольжения покрытия управления были установлены при демонстрации серийных разделов при подобных условиях(состояниях), но без первичных антител. Яркость и контрастные уровни были оценены, используя программное обеспечение C1 (Nikon) и программы Adobe Photoshop 7.0 (Abacus Concepts Inc, Беркли, Калифорния).