Метод оценки ферментативной защиты по изменению активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы

Венозную кровь для определения антиоксидантных ферментов необходимо собрать в пробирки с антикоагулянтом, в качестве которого использовать ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислоту) в количестве 1мг/мл.

Для определения активности антиоксидантных ферментов необходимо получить эритроцитарную массу путем трехкратного отмывания крови охлажденным (5°С) физиологическим раствором. Отделение эритроцитарной массы проводится центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 10 минут. Из полученной эритроцитарной массы готовится на дистиллированной воде раствор гемолизата (1:100). Для полного гемолиза материал необходимо подвергнуть холодовому гемолизу.

В полученном гемолизате эритроцитов активность СОД определить с помощью наборов «Randox» (Великобритания).

Критерии оценки активности СОД (показатели в пределах нормы):

176,00 – 196,00 U/г. Hb.

Для определения активности каталазы исходный гемолизат развести 0,067М Na,K-фосфатным буфером (1:100). Определение активности каталазы провести кинетическим спектрофотометрическим методом прямой регистрацией разложения субстрата фермента - перекиси водорода. За единицу активности каталазы принимают такое количество фермента, которое вызывает падение оптической плотности с 0,45 до 0,4 за 17 секунд.

Состав рабочего буфера: 0,067М фосфатный буфер рН 7,2, 0,01М перекись водорода. Активность выражают в единицах активности на 1 мг гемоглобина. Все измерения выполняются на спектрофотометре Genesys 5 (США), позволяющим снимать оптическую плотность в кинетическом режиме.

Критерии оценки активности каталазы (показатели в пределах нормы):

400 - 475 U/г. Hb.