Работа № 2: Идентификация фармпрепаратов методом тонкослойной хроматографии в незакрепленном слое сорбента

Цель: Приобрести практические навыки выполнения простейших операций метода ТСХ: подготовка тонкого слоя сорбента, нанесение анализируемых проб, хроматографирование в системе растворителей, идентификация фармпрепаратов по величине Rf.

Сущность метода   заключается в том, что разделение веществ проводят в тонком слое сорбента, нанесенном на пластинку. Классическая методика ТСХ включает в себя следующие операции: 1). подготовка тонкого слоя сорбента; 2). нанесение анализируемых проб; 3). хроматографирование в соответствующей системе растворителей; 4). детектирование разделенных зон (если, анализируемые вещества не окрашены); 5). идентификация веществ, на хроматограмме; 6). количественное определение разделенных компонентов.

Наиболее часто применяемые в ТСХ сорбенты - оксид алюминия, силикагель, целлюлоза. В случае использования первых двух принято считать, что механизм разделения адсорбционный, в случае целлюлозы - распределительный. Однако, как и в бумажной хроматографии, на практике часто имеет место комбинированный механизм распределения. Различают два типа используемых слоев: закрепленный и незакрепленный. Пластинки с закрепленным слоем готовят, заливая пластинки суспензией сорбента в воде или органическом растворителе с добавлением связующих веществ (гипс или крахмал).

Незакрепленный слой готовят, разравнивая сорбент по сухой, обезжиренной пластинке до слоя одинаковой толщины. Основные требования, предъявляемые к тонкому слою сорбента - максимальная равномерность и однородность. Оптимальной толщиной слоя в ТСХ считается 200-500 мкм. Главной трудностью и является как раз приготовление тонкого слоя, отвечающего этим требованиям. Преимущества незакрепленного слоя заключаются в том, что пластинки с ним готовятся легко, быстро и при помощи простого вспомогательного оборудования. Но из-за сложности приготовления равномерного слоя, на них трудно получить воспроизводимые результаты. Преимущества закрепленного слоя заключаются в том, что пластинки с ним обладают механической прочностью и их можно готовить впрок. В настоящее время в аналитической практике чаще используют пластинки, приготовленные в заводских условиях. Слой сорбента наносится на алюминиевую фольгу. При тщательной упаковке они хранятся очень долго, просты в использовании и дают хорошо воспроизводимые результаты.

Нанесение анализируемой пробы на пластинку проводят с помощью специальных микропипеток или калиброванных капилляров. Диаметр стартового пятна не должен превышать 3-4 мм, в противном случае на конечной хроматограмме будут очень большие расплывчатые зоны, перекрывающие друг друга.

При выборе растворителей для подвижной фазы учитывают их элюирущую способность, т.е. способность вытеснения ими адсорбированных соединений с сорбента. Существует несколько элюотропных рядов растворителей в порядке увеличения их элюирующей способности. Обычно используется смесь нескольких органических растворителей с разной полярностью (из начала и из конца элюотропного ряда), оптимальное соотношение которых определяется экспериментально.

Хроматографирование проводится в камерах подходящих размеров, снабженных герметично закрывающей крышкой. Используются три основных варианта хроматографирования:  восходящий, нисходящий, горизонтальный. На практике чаще всего пользуются восходящим хроматографированием. Хроматографирование заканчивается, когда фронт растворителя почти достигает противоположного края пластинки.

Детектирование (проявление) хроматограммы необходимо для обнаружения зон неокрашенных веществ. Детектирование проводят с помощью обработки хроматограммы соответствующими реактивами из пульверизаторов. Различают универсальные и специфические реагенты. К универсальным относятся: концентрированная серная кислота, фосфорномолибденовая и фосфорновольфрамовая кислоты - с последующим нагреванием пластинки, йод - пластинки помещают в камеру, насыщенную парами йода. Специфические реактивы используют для открытия отдельных групп веществ - чаще используются реакции на какую-либо функциональную группу. Идентификация веществ на хроматограмме проводится по величине Rf хроматографических зон:                  Rf = l _А/ l _В      где

l _А - расстояние от линии старта до центра хроматографической зоны компонента А

l _В - расстояние от линии старта до линии фронта растворителя.

Идентификация веществ по величине Rf бывает затруднена, а иногда практически невозможна, т.к.. она не является константой веществ, если эксперимент проводится не в строго стандартных условиях. Для надежной идентификации используют "хроматографирование со свидетелем", когда на хроматографическую пластинку параллельно с анализируемыми пробами наносят "свидетель" - вещество, наличие которого предполагают в пробе.

Количественное определение веществ в ТСХ проводят либо прямым методом (непосредственно на хроматограмме), либо косвенным методом (после выделения веществ из тонкого слоя). Прямые методы могут быть неинструментальными (сравнение площади зон анализируемых веществ со стандартом) и инструментальными - с использованием специальных приборов - денситометров. При косвенном определении вещество сначала вымывается (элюируется) из тонкого слоя, а затем определяется каким-либо инструментальным методом (спектроскопия в УФ- и видимой области спектра, флуориметрия, поляро- графия).

ТСХ является доступным и простым в исполнении методом и широко применяется для разделения смесей в фармацевтическом анализе, биохимии, клинической биохимии.

Сущность работы: Анализируемые фармпрепараты (антипирин, димедрол, папаверин, новокаин) различаются типом функциональных групп, поэтому их разделение методом ТСХ проходит достаточно эффективно, и Rf фармпрепаратов значительно отличаются. Это позволяет идентифицировать неизвестный фармпрепарат, сравнивая его Rf c Rf "свидетелей", капли которых наносятся на ту же самую пластинку.

Методика выполнения работы:

1. Определение проводится. методом ТСХ на незакрепленном слое сорбента. В качестве сорбента используются оксид алюминия. На чистую стеклянную пластинку помещают оксид алюминия, с помощью металлического валика добиваются получения тонкого равномерного слоя сорбента.

2. Готовят подвижный растворитель - смесь эфира и хлороформа 1:1.

3. На расстоянии не менее 1 см от края пластинки отмечают линию старта и на нее с помощью капилляра наносят через равные промежутки по капле определяемого фармпрепарата и каждого из "свидетелей".

4. Пластину с нанесенными пробами помещают в камеру (чашку Петри) с растворителем, находящуюся в эксикаторе, под углом 45-60^о, т.е используется вариант восходящей хроматографии. Эксикатор плотно закрывают крышкой. Когда растворитель поднимется почти до верха пластинки, последнюю вынимают и отмечают линию финиша.

5. Пластинку сушат в вытяжном шкафу до исчезновения запаха растворителя. Хроматограмму детектируют (проявляют) в эксикаторе насыщенном парами йода. На дне эксикатора должны быть кристаллы йода.

6. После проявления отчетливых пятен всех веществ, пластинку вынимают из эксикатора и отмечают границы и центр каждого пятна.

7. Измеряют расстояние от линии старта до линии финиша (расстояние пройденное растворителем (l _В) и расстояние от линии старта до центра каждого из пятен (расстояние пройденное фармпрепаратом l _А).  Рассчитывают Rf неизвестного фармпрепарата и "свидетелей".

8. Идентифицируют неизвестный фармпрепарат, сравнивают его Rf c Rf каждого из свидетелей.