Метод иммунофлуоресценции

Метод применяют для обнаружения энтеробактерий в испражнениях, рвотных массах и другом материале от больных или из объектов окружающей среды в качестве экспресс-метода индикации.

Для учета реакции используют люминесцентный микроскоп: МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 или МЛД-1 (последний предназначен для работы в полевых условиях), "Люмам" (Р-1, Р-2, Р-3). При люминесцентной микроскопии применяют специальные осветители: ОИ-18, ОИ-17, ОСЛ-1 или ОИ-28 (портативный).

Препараты для исследования готовят путем непосредственного нанесения материала на предметное стекло (в случаях предположения о массивном обсеменении) или с предварительным подращиванием на питательных средах. В первом случае при исследовании жидкого материала делают тонкий мазок, при оформленном стуле или исследовании пищевых продуктов готовят 20-% суспензию в ИХН. Для мазка используют верхнюю часть суспензии после ее отстаивания в течение 20 минут или центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5-10 минут. При подращивании в соответствующих средах обогащения их выдерживают при 37°C в течение 18-20 часов, на плотных дифференциально-селективных средах - 4 часа, после чего готовят мазки или отпечатки. Лучшие результаты - сочетание исследования прямых мазков и мазков после подращивания. Иммунофлуоресценцию можно использовать при обычном ходе бактериологического анализа, сделав мазки из подозрительных колоний, выросших на плотной среде (Эндо, ЭМС-агар, среда Плоскирева, ВСА).

Для выявления энтеробактерий используют прямой и непрямой люминесцентно-серологический методы.

Прямой метод - мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе и фиксируют 96° этиловым спиртом (можно смесью Никифорова) в течение 15 минут (или путем трехкратного проведения через пламя горелки). Фиксированные препараты немедленно помещают во влажную камеру (чашки Петри, кюветы, эксикаторы с увлажненной ватой или фильтровальной бумагой), наносят на них пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении на срок, указанный в наставлении по применению люминесцирующей сыворотки. После экспозиции мазки тщательно промывают ИХН или 0,15 М раствором NaCl в течение 10 минут, дважды меняя раствор в стаканчике, или под текущей струей, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. В случае необходимости фиксированные мазки можно хранить несколько дней в минусовом отсеке холодильника.

При необходимости корректирования рабочего разведения заведомо известный штамм подвергают окрашиванию люминесцирующей сывороткой, взятой в нескольких разведениях (выше и ниже указанного на этикетке). Максимальное разведение, которое обеспечивает яркое специфическое свечение микробов в данном микроскопе, оценивают как "красящий титр". В качестве рабочего разведения принимают удвоенный "красящий титр".

Мазки исследуют в темной комнате. При использовании иммерсионной системы применяют специальное нелюминесцирующее масло. Для получения достоверных результатов необходимо просматривать не менее 20-25 полей зрения.

Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, имеют яркое зеленоватое свечение периферии клетки, по морфологии соответствующей энтеробактериям. Такое свечение называют специфическим в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки.

Для оценки интенсивности свечения используют систему 4-х плюсов: "++++" - очень яркая флуоресценция на периферии клеток, четко контрастирующая с темным телом бактерий; "+++" - яркая флуоресценция периферии клетки; "++" или "+" - слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Положительными результатами считают реакции на "++++" и "+++" при наличии 2-5 специфически светящихся клеток в каждом поле зрения. В отношении антигенно обособленных энтеробактерий, например S. sounei, для положительного ответа достаточно обнаружить в препарате единичные ярко светящиеся палочковидные микробы.

Прямая микроскопия мазка из нативного материала от больных при высокой концентрации возбудителя (500 тысяч - 1 млн клеток в 1 г) позволяет дать положительный ответ через 45-60 минут. При использовании метода накопления и при незначительной концентрации возбудителя (тысячи - десятки тысяч клеток) результаты могут быть получены в период от 5 до 20 часов.

Непрямой метод - на препарат, содержащий антиген, наносят капли диагностической немеченной сыворотки и оставляют при комнатной температуре на 10-20 минут (во влажной камере), затем промывают 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2-7,4) дважды по 10 минут для удаления несвязавшейся сыворотки. Мазки подсушивают на воздухе и на 10-20 минут наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого получена примененная иммунная сыворотка. Мазки промывают и просматривают, как при прямом методе. Для непрямого метода обязателен контроль: изучаемый антиген, обработанный люминесцирующей сывороткой.