Среда Stonebrinks для M. bovis. Компоненты. Солевой раствор: натрия пируват — 5 г, КН2Р04 — 2 г, дистиллированная вода — 300 мл.
Смесь красителей: кристаллвиолет — 100 мг, малахитовый зеленый — 800 мг, дистиллированная вода — 100 мл; 20 свежих куриных яиц.
Приготовление среды: устанавливают рН солевого раствора добавлением раствора Na2HPO на уровне 6,5. Раствор разливают в емкости по 100 мл. Оба раствора стерилизуют при 121 °С в течение 15 минут. Яйца моют, высушивают и помещают на 30 минут в 75%-ный изопропиловый спирт. Подсушивают яйца на воздухе под ультрафиолетовыми лучами, вскрывают, содержимое помещают в емкость с раствором и гомогенизируют. Полученную смесь разливают по 12 мл в пробирки, которые в наклонном положении выдерживают 40-60 минут в водяной бане при 80°С. Остужают 30 минут и инкубируют при 37°С 24-48 часов для впитывания влаги в среду.
Модифицированная среда Дюбо-Смита. Компоненты: К2НР04 —
4 г, Na2HP04 — 6,25 г, MgS04 — 0,01 г, СаС12— 0,0005 г, ZnS04 — 0,0001 г, CuS04 — 0,0001 г, лимоннокислое аммонийное железо — 0,05 г, аспарагин — 1 г, гидролизат казеина — 80 мл, спиртовой экстракт M. phlei —
20 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота — до 20%, пенициллин — 50 ЕД/мл, агарДифко — 15 г, дистиллированная вода — до 1000 мл.
|
|
Применяют для культивирования M. paraluberculosis.
Среда Петраньяни. Встерильную колбу со стеклянными шариками вносят 250 мл свежего цельного молока, 6 г картофельной муки, 1 г пептона, одну мелко нарезанную картофелину размером с куриное яйцо. Помешивая, выдерживают колбу с содержимым в кипящей водяной бане 10 минут, охлаждают до 60° С и вносят 1 желток и содержимое 4 свежих яиц, 12 мл стерильного глицерина, 6 мл 2%-ного (на дистиллированной воде) раствора малахитового зеленого. Компоненты перемешивают, фильтруют через двойной слой марли, разливают по стерильным пробиркам и свертывают в наклонном положении в аппарате Коха при 85° С 30 минут. В последующие двое суток прогревают до 70° С по 15 минут. Готовая среда светло-зеленого цвета. Хранят на холоде.
Среда Левенштейна - Иенсена. Готовят солевой раствор следующего состава: в 600 мл дистиллированной воды растворяют первоначально 2,4 г одноосновного фосфата калия, далее последовательно 0,24 г сульфата магнезии, 3,6 г L-аспаргина, 12 г химически чистого глицерина. Раствор стерилизуют текучим паром 120 минут, добавляют 30 г картофельного крахмала, разливают в колбы по 150 мл и нагревают 8 кипящей водяной бане до загустения смеси. Затем готовят яичную массу. В литровую термо колбу с бусами асептично вносят содержимое 20-22 куриных яиц (свежих), перемешивают, фильтруют через марлю. К 1000 мл яичной смеси добавляют 200 мл стерильного 2%-ного раствора малахитового зеленого и перемешивают. К 1 л яичной смеси с малахитовым зеленым добавляют 600 мл солевого раствора с крахмалом, выдерживают около 1 часа до исчезновения пузырьков, асептично разливают по 8-10 мл пробирки и в скошенном положении в аппарате Коха прогревают при 80-85° С 40 минут. Далее среду выдерживают в термостате для контроля стерильности. Хранят на холоде. Если среду используют для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, крахмал не добавляют.
|
|
Яичная среда Гельберга. Пять свежих куриных яиц моют, обтирают спиртом, слегка обжигают, вскрывают. Асептично извлекают два желтка и помещают их в стерильную колбу с бусами, встряхивают. Добавляют 50 мл солевого раствора, 50 мл молока, 50 мл картофельного отвара, 2,5 мл 10%-ного стерильного раствора лимонной кислоты. Компоненты перемешивают, добавляют 3,5 мл 2%-ного стерильного раствора малахитового зеленого и вновь содержимое колбы тщательно перемешивают. Смесь фильтруют через стерильную марлю и по 4-6 мл разливают в пробирки. Стерилизуют в аппарате Коха при 85° С 60 минут однократно. Готовую питательную среду для контроля стерильности выдерживают 48 часов в термостате. Используют в течение недели после изготовления при хранении на холоде.
Приготовление картофельного отвара. Очищенный и нарезанный картофель заливают двойным количеством воды (вес/вес), кипятят 15 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют при 120° С 20 минут.
Приготовление молока. Снятое коровье молоко разливают по 110 мл в колбы, стерилизуют первый день при 105°С 10 минут, второй - 15 минут текучим паром. Раствор малахитового зеленого (2%-ный) стерилизуют при 120° С 20 минут. Кристаллическую лимонную кислоту (10 г) растворяют в 100 мл дистиллированной воды, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют 20 минут при 120° С.
Приготовление солевого раствора. Берут К2НР04 — 1 г, натрия лимоннокислого — 1 г, магнезии сернокислой — 1 г, пептона —2,6 г, глицерина химически чистого — 30 мл, воды дистиллированной — до 1000 мл. Каждый компонент растворяют в небольшом количестве воды, потом вносят глицерин и добавляют дистиллированную воду до 1000 мл. Смесь слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют 20 минут при 105° С.
Картофель Павловского. Белый картофель тщательно моют с мылом, насухо вытирают, очищают, прокаленным ножом срезают оба полюса картофелины. Специальным стерильным буром вырезают из картофеля цилиндр длиной 5-6 см и шириной в соответствии с диаметром пробирки. Цилиндры по диагонали разрезают на 2 клина и опускают последние в 5%-ную стерильную глицериновую воду на 1-2 часа.
Далее клинья подсушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги и пинцетом опускают в пробирки Ру с перетяжкой, содержащие в нижней части 5%-ную стерильную глицериновую воду (рН 7,0-7,2), с расчетом, чтобы нижняя часть картофельного клина касалась жидкости. Пробирки стерилизуют при 110° С 10 минут. Сразу после стерилизации пробирки размещают в наклонном положении поверхностью посевов вниз, что позволяет сохранить их влажными. Стерильность контролируют термостатированием.
Среда Петрова. Смешивают 500 г мясного говяжьего фарша с 500 мл 15%-ной глицериновой воды и выдерживают на холоде 24 часа. Перед употреблением фильтруют. Асептически извлекают содержимое куриных яиц, помещают в мерный цилиндр и перемешивают. Далее готовят 1%-ный раствор генцианвиолета и выдерживают 24 часа в термостате.
Для изготовления сред в одну часть мясного настоя вносят 2 части яичной смеси и 1 мл раствора генцианвиолета на каждые 100 мл среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают первый день при 85° С, а два последующих дня — при 75° С по 40-60 минут. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 дней.
|
|
Яично-картофельная среда Виноградова. Вымытый, очищенный и нарезанный мелкими кусочками картофель заливают водой (1:2) и варят при 120° С 1,5 часа. Горячий отвар фильтруют через марлю. В фильтрат вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимости. При изготовлении среды к 1 части картофельного отвара добавляют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по пробиркам, прогревают при 90° С. Затем в каждую пробирку вносят 0,5-1,0 мл МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизуют при 100° С два дня по 45 минут.
Среда Дорсе. Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 минут в сосуд с этиловым спиртом, затем обжигают на пламени горелки, содержимое асептично переносят в колбу с известным весом и доливают 10% (вес/вес) дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и свертывают в наклонном положении при 70-75° С 60 минут. Контролируют на стерильность, выдерживая в термостате трое суток.
Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом. Среда Левенштейна-Иенсена без крахмала. Пробки в пробирках герметизируют парафином, хранят при 4° С. Среда пригодна для использования в течение полугода.
Кислотная яичная среда № 1a. В 600 мл дистиллированной воды растворяют 6,3 г КН2Р04, 0,3 г MgS04, 12 мл глицерина и автоклавируют при 110° С15 минут. К раствору асептически добавляют 1100 мл полной яичной смеси, 3 мл 1N НС1,11 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный, вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина. Среду разливают по пробиркам, прогревают при 75-78° С 45 минут.
Кислотная яичная среда № 1в. Готовится аналогично среде 1а, но вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата.
Кровяная среда. Непосредственно перед посевом дистиллированной водой разводят 1:2 стерильную цитратную кровь, разливают по 3 мл в пробирки и вносят раствор пенициллина из расчета 2 ЕД/мл.
|
|
Синтетическая среда Вишневского. Берут 3 г аспарагина, 7 г щавелевокислого аммония, 5 г двухосновного фосфорнокислого магния, 0,5 г сернокислого магния, 0,05 г сернокислого железа, 40 мл глицерина и дистиллированной воды до 1000 мл. Подщелачивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 минут при 120° С.
Среда Данкина. Используют для культивирования M. paratuberculosis. На 4%-ном глицериновом бульоне выращивают 10-15 суток культуру M. phlei. Путем фильтрации через бумажный фильтр отделяют бактериальную массу, переносят ее в ступку с 10 мл глицерина и 100 мл печеночного экстракта Дедляу. Смесь несколько минут кипятят, отстаивают и надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют содержимое трех куриных яиц. Перемешивают и вносят 2,5% (объем/объем) 1%-ного спиртового раствора ген-цианвиолета. Фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и помещают в аппарат для свертывания. Стерилизуют дробно, первый день при 80° С до уплотнения среды и два дня подряд по 60 минут при 80° С.
Печеночный экстракт по Дедляу. В 1000 мл воды вносят 400 г говяжьей печени, стерилизуют 120 минут текучим паром и фильтруют через марлю. Устанавливают рН — 7,0. Фильтрат разливают по емкостям и стерилизуют при 100° С по 20 минут в течение трех дней.
Среда Ренжара. Используют для культивирования M. paratuberculosis. Смешивают 4 части печеночного (рН 7,3) и 8 частей телячьего бульона (рН 7,3), добавляют 3% агар-агара. После растворения агара смесь фильтруют, вносят 5% глицерина и 1 часть глицериновой вытяжки M.phlei, стерилизуют при 115° С 20 минут. Среду охлаждают до 55° С. Добавляют
1 часть сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при 56-58° С, разливают по пробиркам и скашивают.
Приготовление вытяжки из M. phlei. Бактериальную массу из M.phlei, выращенную на глицериновом бульоне, фильтруют через бумажный фильтр, 5 г биомассы растирают с 30 мл 20%-ного раствора глицерина в дистиллированной воде, встряхивают, прогревают при 110-120° С
1,5 часа. Центрифугированием отделяют жидкую часть, которую и используют для приготовления среды.
Приготовление спиртового экстракта из М. phlei (микобактин). Культуру микобактерий Тимофеевой травы выращивают в МПБ (4% пептона, 10% глицерина, рН 7,2) в течение 3-4 недель, фильтруют через бумажный фильтр. Осадок промывают стерильной дистиллированной водой, прогревают в аппарате Коха при 80° С в течение 30 минут, высушивают в эксикаторе над СаС12 или в термостате при 45° С и растирают в порошок. 20 г порошка вносят в 150 мл этанола и трехкратно экстрагируют кипячением в колбе с обратным холодильником. Все порции экстракта объединяют и оставляют на ночь.
Надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, сливают в колбу, сгущают при пониженном давлении до формирования вязкой красновато-оранжевой жидкости, которую смешивают с 80 мл 50%-ного раствора глицерина на дистиллированной воде. Устанавливают рН 7,6, прогревают в кипящей водяной бане 10 минут. Затем жидкость помещают в делительную воронку и оставляют на ночь. Экстракт хранят при комнатной температуре.