Двойная радиальная иммунодиффузия

Принцип метода. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, помещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).

Методика. Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15 М NaCl) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый гель наносят на сторого горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают дунки при помощи готовых штампов или вырезают из стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга на расстоянии от 4 до 10 мм. В одни лунки вносят сыворотку, в другие – антигены. После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4°, 20° или 37°С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 часов и в некоторых случаях может достигать 6-7 дней. По окончании иммунодиффузии можно непосредственно оценивать результаты по влажному препарату. Возможен другой способ оценки результатов. Для этого нужно сначала отмыть непреципитирующие субстанции замачиванием пластины 2-3 раза на 12 часов в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40-50°С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии.

Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигенов неидентичны, и следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой «шпоры». «Шпора» часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигеном сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию шпоры.

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки.

Основные типы преципитации представлены на рис. 3.

Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2-3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные.

Титрование. Для титрования растворов антигена и антисыворотки располагают лунки так, как показано на рис. 4.

Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:

1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок.

2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата.

3. Интенсивность и ширину плюс преципитации.

Наибольшее разведение, при котором образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигена.

Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнивания со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена.