Тимоловая проба по Хуэрго и Попперу

Принцип метода. Химическая сущность ее заключается в образовании глобулин-тимол-липидного комплекса, содержащего 40% глобулинов, 32% тимола, 18% холестерола и 10% фосфолипидов, вызывающего помутнение раствора при взаимодействии сыворотки с тимоло-вероналовым буфером.

Реактивы

1.Этанольный раствор тимола, 100 г/л. К 100 г очищенного тимола добавляют 96% раствор этилового спирта до конечного объёма 1 л в мерной колбе.

2. Буферный раствор. 2,76 г веронала и 2,06 г мединала (веронала натрия) растворяют в 1 л дистиллированной воды.

3. Тимоло-вероналовый буфер. В мерной колбе на 100 мл смеси 80 мл буферного раствора (2) и 0,1 мл спиртового раствора тимола; смесь встряхивают и доливают буферным раствором до метки (рН должен составлять 7,55).

4. Стандартная суспензия сульфата бария. Готовится из раствора хлористого бария, получаемого внесением 1,175 г кристаллического ВаСl₂·2Н₂О в мерную колбу вместимостью 100 мл с последующим добавлением дистиллированной воды до метки и 0,2 н раствора серной кислоты.

Ход определения. К 6 мл (3 мл) тимоло-вероналового буфера прибавляют 0,1 мл (0,05 мл) негемолизированной сыворотки, содержимое пробирки перемешивают, оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре (25˚С), а затем фотометрируют при длине волны 660 нм и учитывают показания абсорбции в сравнении с таковыми контрольной пробы (6 или 3 мл буферного раствора – 2).

Расчёт производят по калибровочной кривой. Для её построения из стандартной суспензии ВаSО₄ (реактив 4) готовят ряд разбавлений, которые получаются при добавлении к стандартной смеси раствора серной кислоты. Найденные значения абсорбции соответствуют единицам помутнения по Shank и Haagland (S-H).

Оптическую плотность смеси, приготовленной из 1,35 мл стандартной суспензии (реактив 4) и 4,65 мл раствора серной кислоты (0,2 н),

принимают за 5 ед S-H; смеси, состоящей из 2,70 мл суспензии и 3,30 мл кислоты – за 10 ед, а из 5,40 мл суспензии и 0,60 мл кислоты – за 20 ед S-H.

Приготовленные таким образом калибровочные смеси тщательно встряхивают и тотчас фотометрируют при длине волны 660 нм (630-690 нм: красный светофильтр), используя кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

Контрольной пробой служит соответствующий объем дистиллированной воды. На основании полученных данных строят калибровочную кривую.

Показатели пробы у практически здоровых людей в норме состав-ляют 0-4 ед S-H.