У молоди белуги и русского осетра

Примечаяие. В числителе — концентрация белка у контрольной группы в остром опыте; в знаменателе — концентрация белка у контрольной группы в подостром опыте.

Острое отравление метафосом молоди белуги привело к снижению концентрации сывороточного белка почти на 50%, яланом — на 40% и пропанидом — на 30%. Подчеркнем, что столь глубокие сдвиги уровня протеинами развились в течение 24 ч контакта рыб с ядом.

Трудно объяснить истинную причину глубокого и стремительного снижения концентрации сывороточного белка. Возможно, оно связано с перераспределением белка между тканями и кровью или снижением процессов биосинтеза белка печенью. Однако нельзя исключить в качестве причины столь резкой гипопротеинемии и нарушение водно-солевого обмена, вследствие которого могло произойти «разжижение» крови. Этот вопрос заслуживает специального изучения.

Сходные по направленности и выраженности изменения общего сывороточного белка отмечены и в подострых опытах с молодью белуги, длившихся 10 сут. Исключение составляет ялан, подострое отравление рыб которым привело к снижению концентрации сывороточного белка лишь на 13% против 40% при остром.отравлении. В опытах же с пропанидом отмечена противоположная картина: при длительном его воздействии на рыб концентрация белка снизилась на 59% против 30% при остром отравлении. Только в опытах с метафосом отмечено примерно одинаковое (по 50%) снижение концентрации сывороточного белка при острой и подострой концентрации токсиканта.

Несколько иная картина выявляется при анализе результатов определения сывороточного белка у молоди русского осетра, подвергнутой воздействию тех же трех пестицидов: при остром отравлении рыб яланом и метафосом концентрация сывороточного белка снизилась на 24 и 15% (соответственно) и практически не изменилась (даже несколько повысилась) в опытах с пропанидом. Снижение концентрации исследованных пестицидов вдвое и увеличение времени наблюдений до 12 сут оказали более выраженный токсический эффект: концентрация сывороточного белка более всего снизилась у мальков русского осетра, отравленных метафосом, — на 50,5%, затем у мальков, отравленных яланом, — на 32%, и только у мальков, отравленных пропанидом, она снизилась всего лишь на 6%.

Анализ полученных данных приводит к выводу о том, что воздействие на рыб любого из исследованных пестицидов снижает содержание общего сывороточного белка, оказывая, по-видимому, гепатотропное действие. Наиболее выражено оно при воздействии на организм метафоса я проявляется как в острых, так и в подострых опытах. Выраженность гипопротеииемического эффекта пестицидов определяется их концентрацией, временем действия на организм и видовыми особенностями ток-сикорезистентности рыб.

Безусловно, концентрация общего сывороточного белка является важным интегральным показателем белкового обмена, его направленности и интенсивности. Как показали наши исследования, она претерпевает существенные изменения под влиянием токсикантов различной природы. Однако для более глубокого понимания характера воздействия токсикантов на белковый обмен у рыб необходимо раскрытие механизмов изменения уровня протеинемии, т. е. выявление именно тех фракций белкового состава сыворотки крови (альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов), за счет которых снижается концентрация общего сывороточного белка. Теоретически мыслимы варианты, когда тот или иной токсикант может оказывать угнетающее воздействие, скажем, на синтез альбуминов и стимулировать образование одной из фракций глобулинов.

Экспериментальная проверка высказанных соображений была осуществлена нами в 1965 г. в опытах на ссвсрокаспийской севрюге, подвергнутой токсическому воздействию сточных вод сложного состава, в которых ведущая роль принадлежала ядам органического ряда с преимущественным действием на кровь [183]. Электрофоретическнй анализ сывороточных белков у подопытных севрюг с выраженными клиническими признаками отравлеиия выявил существенные изменения относительного содержания основных фракций (альбуминов и глобулинов) по сравнению с их количеством у контрольных (здоровых) севрюг. У отравленных севрюг содержание альбуминов (25,6%) оказалось заметно ниже, чем у здоровых рыб (34,3%), а содержание глобулинов, напротив, выше (74,3%), чем у контрольных рыб (65,7%). В соответствии с этим альбумин-глобулиповый коэффициент у подопытных рыб (0,35) на 34% ниже, чем у контрольных (0,53). Еще более существенные различия между подопытными и контрольными севрюгами выявляются при сопоставлении у них относительного содержания отдельных фракций глобулинов. Так, относительное содержание α-глобулинов у отравленных рыб (13,8%) в 2 с лишним раза выше, чем у здоровых (6,4%), а содержание β-глобулинов в 3 с лишним раза выше (27,3 % и 8,0 % соответственно), в то же время содержание высокомолекулярных (наименее подвижных) белков β₂-глобулинов+γ-глобулинов (методом электрофореза на бумаге их трудно разделить) у отравленных севрюг (33,1%) значительно ниже, чем у здоровых (51,1%).

Основные результаты электрофоретического анализа сывороточных белков у подопытных и контрольных рыб были подтверждены с помощью одной из наиболее чувствительных проб коллоидоустойчивости белков — коагуляционной ленты Вельтмана [183]. Из 13 обследованных рыб только у одной особи коагуляционная проба оказалась в пределах нормы — 6-7 ед., у остальных рыб лента Вельтмана была смещена резко влево (2-3 ед.), что свидетельствует о серьезном нарушении в соотношении альбумин-глобулинов, увеличении грубодисперсиых фракций глобулинов и понижении коллоидной устойчивости белков. Результаты этой серии опытов однозначно свидетельствуют о нарушении нормального хода синтеза белка и угнетении функционального состояния печени отравленных рыб.

Совокупность полученных нами в середине 60-х годов данных однозначно свидетельствует о влиянии различных групп токсикантов на белковый обмен, что находит свое отражение в изменении концентрации общего сывороточного белка и его основных фракций (альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов).

В дальнейшем этот вывод был неоднократно подтвержден и тем самым экспериментально обоснована принципиальная возможность использования сывороточных белков в качестве биохимического показателя токсического действия различных групп веществ [127, 227, 71, 291, 80, 114, 122, 236]. Приведем лишь некоторые примеры.

Отравление карпов различными пестицидами вызывает изменение концентрации сывороточных белков и их отдельных фракций, однако направленность этих изменений и их выраженность определяются природой токсиканта и его концентрацией [227]. Воздействие фторсодержащих ядохимикатов на рыб снижает концентрацию общего сывороточного белка (примерно на 20%) и альбуминов, но увеличивает содержание глобулинов. Однонаправленные, но более выраженные (до 39%) изменения концентрации общего сывороточного белка отмечены в острых (24-72 ч) и хронических (60 сут) опытах с гербицидом 2,4-Д. Отравление рыб севином (производным карбаминовой кислоты) в острых опытах вызывало снижение концентрации общего сывороточного белка на 23%, а в хронических опытах имели место маловыраженпые изменения. Разнонаправленные и к тому же незначительные сдвиги уровня протеинемии зарегистрированы в опытах с тремя фосфорорганическими пестицидами. Острое отравление карпов метилнитрофосом (МИФ) снижает содержание общего сывороточного белка, а также α- и β-глобулинов. Фосфамид не оказывает влияния на фракционный состав сывороточных белков, но несколько (на 10%) снижает содержание общего сывороточного белка. Наконец, трихлормстафос (ТХМ-3) несколько увеличивает содержание α- и γ-глобулннов, а также общего сывороточного белка.

Значительно более выраженные изменения со стороны сывороточных белков выявлены в опытах на карпах с другим пестицидом фосфорорганического ряда — бензофосфатом [71]: острое отравление рыб (96 ч) вызвало гппопротеинсмию и снижение концентрации альбуминов на 33,9%, β-глобулинов на 19,7% и γ-глобулинов на 26%. В хронических опытах, продолжавшихся около 3 мес, отмечена статистически недостоверная тенденция к снижению концентрации общего белка и основных его фракций.

Противоположные по направленности изменения уровня протеинемин описаны у личинок севрюги, подвергнутых воздействию двух фосфорорганических пестицидов: метиднитрофоса и изофоса [129]. Воздействие на рыб высоких концентраций этих пестицидов (0,1 и 1 мг/л) приводило к увеличению содержания общего белка на 20-30%, а более низкие концентрации не оказывали никакого влияния.

Еще одно исследование белкового состава сыворотки крови карпа, отравленного хлорофосом (из группы фосфорорганических пестицидов) и полихлорпиненом (из группы хлорорганических пестицидов), выполнено В. И. Козловской и др. [122]. Привлекает внимание скоротечное изменение уровня протеинемии и соотношения альбумин-глобулинов при остром отравлении рыб хлорофосом. Уже через 3 ч после воздействия на них раствора хлорофоса концентрацией 500 мг/л содержание общего сывороточного белка увелйчивается на 62% (с 21,3 до 35,5 мг/л), остается примерно на этом уровне в течение 7 ч и лишь через 24 ч (видимо, незадолго до смерти) несколько снижается (до 28,5 мг/л), но все еще остается выше (на 34%), чем у здоровых карпов. Одновременно с этим происходит увеличение относительного содержания альбуминов на 47% и снижение глобулинов примерно на 20%.

В отличие от хлорофоса полихлорпинен концентрацией 1 мг/л вызывает повышение содержания общего белка только после 7-часового контакта рыб с ядом, а через 24 ч оно достигает наивысшего уровня — 49,1 мг/л у отравленных карпов против 29,4 мг/л у здоровых, т. е. увеличивается на 67%. Относительное содержание альбуминов и глобулинов не претерпевает существенных изменений, и остается непонятным, за счет чего у рыб произошло увеличение концентрации общего сывороточного белка. Примечательна еще одна деталь. В подострых опытах с обоими пестицидами, длившихся 6 сут (ежедневно в аквариум вносили по 1/10 остаотоксичной концентрации), на электрофореграммах отравленных рыб в области альбуминов и глобулинов наблюдалось увеличение количества белков. Однако определение концентрации общего сывороточного белка спектрофотометрическим методом выявило тенденцию к ее снижению. Авторы не объясняют этих расхождений.

Следует отметить, что результаты, их, опытов с хлорофосом, согласно которым у отравленных рыб происходит увеличение относителыгого содержания альбуминов и снижение глобулинов, находятся в противоречии с многочисленными литературными данными по влиянию на сывороточные белки рыб ядов органического ряда, в том числе и пестицидов [183, 1'27, 227, 71]. Из этих данных следует, что при изменении уровня протеинемии относительное содержанке альбуминов всегда, снижается, а относительное содержание α- и β-гдобулинов, как правило, увеличивается. Такое направление изменений становится понятным, если учесть, что печень, представляющая собой основной орган, в котором происходят процессы детоксикации чужеродных веществ (ксенобиотиков), одновременно - является и местом синтеза альбуйинов. При нарушениях функций печени у отравленных рыб должен угнетаться и синтез альбуминов.

Что касается повышения содержания грубодисперсных белков α-, β- и γ-глoбyлинoв, то оно может определяться эксудативно-пролиферативными процессами, развивающимися в организме отравленных рыб. Возвращаясь к данным В. И. Козловской с соавторами [122] об увеличении относительного содержания альбуминов и снижении глобулинов, необходимо отметить, что авторы использовали в своих опытах метод дискоэлектрофореза в полиакриламидном геле. Это один из наиболее совершенных методов, характеризующийся высокими разрешающими способностями. Однако идентифицировать на дискофореграммах отдельные фракции белков у костистых рыб чрезвычайно трудно. Не исключено, что именно эти трудности и послужили одной из причин ошибочного вывода об увеличении относительного содержания альбуминов у карпов, подвергнутых воздействию высевкой концентрации хлорофоса (500 мг/л).

В литературе имеются указания на изменения содержания сывороточных и тканевых белков у рыб и под влиянием других токсических веществ. Так, введение рыбам (S. guingueradiata) четыреххлористого углерода в дозе 0,1-0,2 мг на 100 г массы приводило к снижению концентрации сывороточных альбуминов и увеличению глобулинов. Кроме того, по мнению авторов, на протеинограммах отравленных рыб появлялись новые компоненты, вследствие чего общее количество их увеличивалось [766]. Аналогичные качественные изменения фракционного состава сывороточных белков отмечены несколько ранее [428] у одного из видов пресноводных рыб (Channa punctatus) при действии сублетальных концентраций двух фосфорорганических инсектицидов (базудина и метилпаратиона), а затем и у карпов, отравленных хлорофосом и полихлорпиненом [122]. Однако при действии на сигов сточных, вод сложного химического состава происходит некоторое обеднение фракционного состава мышечных белков (миогенов) за счет выпадения отдельных компонентов [325].

Хотя мышечные белки по фракционному составу и количественному содержанию более стабильны, чем сывороточные белки, но и они претерпевают изменения под влиянием различных токсических веществ. Некоторые тяжелые металлы, например, такие, как медь, хром, олово и кадмий, снижают содержание растворимых мышечных белков у рыб [483]. Снижается оно и под влиянием нефтяного загрязнения [94]. Вообще токсическое действие тяжелых металлов и нефтепродуктов проявляется в изменении содержания не только мышечных, но и сывороточных белков рыб. Воздействие на рыб ртути и свинца, например, вызывает снижение концентрации общего сывороточного белка и альбуминов, но приводит к увеличению концентрации α- и β-глобулинов [80]. Направленность этих изменений и их характер аналогичны отмеченным нами в опытах с ядами органического ряда [183]. Снижение концентрации общего сывороточного белка у рыб (белуги, сазана) отмечено и в опытах с растворенной нефтью [114]. Для понимания механизмов изменения концентрации сывороточных и тканевых белков несомненный интерес представляют материалы, полученные Л. В. Михайловой [236] в опытах на различных видах рыб (карась, карп, пелядь) с растворимой фракцией нефти (ВРФН). Помещение подопытных карасей в токсический раствор, содержащий 0,05-0,1 мг/л ВРФН, уже через 3 ч приводило к снижению скорости включения мстионина-35 в белки печени и почек и снижению концентрации белка в этих органах, характеризующихся, как известно, высокой метаболической активностью. Таким образом, изменение скорости и интенсивности биосинтеза белка — один из реальных механизмов воздействия токсических веществ на обмен веществ рыб, а изменение концентрации общего сывороточного или тканевого белка — хороший биохимический показатель как острого, так и хронического отравления рыб.

Другим важнейшим биохимическим показателем токсического действия различных групп веществ на белковый обмен может служить уровень содержания аммиака в крови и тканях, прежде всего в мозговой ткани. Как известно, рыбы (наряду с ракообразными) относятся к группе аммониотелических животных, у которых конечным продуктом катаболизма белков и аминокислот является аммиак. Аммиак и его водный раствор аммоний высокотоксичны. В нормальных условиях образующийся в различных тканях аммиак детоксици-руется с помощью глютаминовой кислоты. Взаимодействие аммиака и глютаминовой кислоты ведет к образованию глютамина, который поступает в печень, где от него отщепляется аммиак. Нарушение этих тонко сбалансированных процессов образования и детоксикации аммиака в центральной нервной системе теплокровных животных приводит к развитию двигательного возбуждения и судорожного состояния. Однако все имевшиеся к началу 60-х годов экспериментальные данные были получены на теплокровных животных, а динамика изменений количества аммиака во время судорожного приступа у рыб оставалась вне поля зрения исследователей. Между тем многие яды органического ряда, в частности фенолы, вызывают у рыб бурное двигательное возбуждение с последующими судорогами. Учитывая это обстоятельство, мы решили провести специальное исследование для выявления роли аммиака в происхождении основных симптомов отравления рыб ядами органического ряда.

Опыты проводили на модели фснольной интоксикации карасей (Carassius carassius) в 1962-1963 гг. [184, 185]. В обшей сложности в опытах использовано 166 рыб 3-4-летпего возраста. Подопытные и контрольные караси, отловленные в одном пруду, содержались в 300-литровых плексигласовых аквариумах с проточной водой. После отлова рыб выдерживали в аквариалыюй в течение 7-10 сут. Опыты проводили при температуре 15°С, рН 7,1, содержании кислорода 5,9-6,4 мг/л и жесткости 10,3°Н. Подопытных карасей погружали в раствор фенола (100 мг/л), что вызывало у них развернутую картину фенолыюй интоксикации со всеми характерными для нее симптомами: двигательным возбуждением, опрокидыванием на бок, манежными движениями и судорогами. Для того чтобы проследить за динамикой содержания аммиака в головном мозге по ходу развития фенольной интоксикации, определяли его количество через 7, 15, 30, 60 и 120 мин контакта рыб с фенолом микродиффузионным методом в прописи В. С. Асатиани [17]. Результаты опытов подвергали статистической обработке с помощью непарамстрического критерия Вилкоксона.

Изучение количества аммиака в головном мозге карасей на разных этапах развития фенольной интоксикации показало, что этот конечный продукт белкового обмена претерпевает существенные изменения (табл. 14): в четырех из пяти серий опытов было отмечено резкое увеличение количества аммиака (в 2 раза больше, чем в контроле). Сопоставляя динамику изменения количества аммиака в мозге с качественным составом внешнего симптомокомплекса фенолыюй интоксикации, можно заключить, что количество аммиака претерпевает 2-фазовое изменение параллельно с 2-фазовым протеканием фенольного отравления карасей.

Уже через 7 мин после погружения испытуемых карасей в раствор фенола, во время которых имеет место чрезвычайно сильное локомоторное возбуждение, количество аммиака в головном мозге увеличивается в 1,9 раза в сравнении с его исходным уровнем. В последующие 15 мип беспорядочная бурная двигательпая активность постепенно идет на убыль, рыбы теряют рефлекс равновесия и находятся в боковом положении, сопровождающемся интенсивными клоническимн судорогами. Количество аммиака в головном мозге подопытных карасей по-прежнему остается высоким: в 1,8 раза превышает его содержание у контрольных карасей. Даже к 30-й минуте, когда у большинства подопытных рыб отмечается полная потеря двигательной активности, количество аммиака все еще в 1,7 раза превышает его содержание у контрольных рыб.

Через 60 мин после погружения рыб в токсический раствор фенола первая стадия возбуждения, включающая такие характерные реакции, как бурная двигательная активность, потеря рефлекса равновесия и импульсивное перемещение в боковом положении, сменяется стадией торможения, характеризующейся в основном полным угнетением дыхания, потерей ориентировочной реакции и резким ослаблением чувствительности к механическим раздражителям. Количество аммиака в мозге у опытных рыб в это время хотя и остается выше (в 1,27 раза), чем у контрольных, однако оно значительно меньше, чем у подопытных карасей, находившихся в контакте с фенолом первые 15 мин. И наконец, через 120 мин после появления первых симптомов фенольного отравления количество аммиака в мозге у подопытных карасей резко падает и оказывается даже несколько меньше, чем у контрольных рыб.

Таблица 14.