К молочнокислым бактериям, широко используемым для производства пробиотиков, относятся молочнокислые стрептококки и лактобактерии.
B молочной промышленности для изготовления различных продуктов из молочнокислых стрептококков наиболее часто применяют мезофильные стрептококки S.lactis и S.cremoris, которые относятся к группе гомоферментативных, разлагающих молочный сахар до молочной кислоты. В отдельных случаях они образуют небольшие количества летучих жирных кислот и ацетона; являются активными кислотообразователями, оптимальной температурой их роста является 30°С - для S.lactis и 25°С - для S.cremoris.
Мезофильные гетероферментативные стрептококки (S.paracitrovorus, S.diacetilactis, S.acetoinicus, S.citrovorus) при расщеплении лактозы образуют молочную кислоту, при расщеплении лимонной кислоты образуют диацетил. Оптимальной температурой их роста является 30°С, а для S.citrovorus и S.paracitrovorus - 21 - 25°С.
Кроме мезофильных к молочнокислым стрептококкам относятся и термофильные. Представлены они одним видом - S.thermophilus. Оптимальной температурой их роста является 40 - 45°С. Колонии имеют тёмную зернистую структуру, в мазках клетки крупные, сплющены и располагаются цепочками разной длины. Являются сильными кислотообразователями.
|
|
К палочковидным молочнокислым бактериям относятся род Lactobacterium.
К подгруппе термофильных палочек относятся L.bulgaricum и L.acidophilum, применяемые для приготовления кисломолочных продуктов, а также L.helveticum, используемые в сыроделии. Все они являются факультативными анаэробами. Плохо растут на поверхности агаровых сред, лучше в столбике агара. На поверхности плотных сред колонии локонообразные, а в глубине имеют форму кусочков ваты, то есть колонии R-формы. В мазках располагаются одиночными клетками или цепочками. Являются энергичными кислотообразователями (до 300°С), молоко сбраживают за 3 - 5 ч. Оптимальной температурой роста является 40°С (для L.acidophilum - 37°С).
К подгруппе стрептобактерий относятся L.casei и L.plantamm, которые принимают участие в созревании сыра. Они представляют собой палочки разной длины, располагающиеся одиночно, попарно или в виде коротких и длинных цепочек. На плотных средах образуют мелкие круглые колонии (S-формы), иногда с выростом. Оптимальная температура роста около 30°С. Являются слабыми кислотообразователями, не свёртывают молоко. По своим свойствам близки к ароматообразующим стрептококкам.
В настоящее время у всех видов молочнокислых бактерий найдены бактериофаги. Они являются строго специфичными, и поэтому с помощью явления бактериофагии можно дифференцировать молочнокислые бактерии. Основополагающим является то, что бактериофаги нарушают молочнокислое брожение при производстве творога, простокваш, сыров с низкой температурой второго нагревания.
|
|
Для более точной идентификации молочнокислых бактерий используют серологические методы. Наиболее приемлемой является реакция преципитации. Установлено, что по этой реакции молочнокислые стрептококки более однородны, чем молочнокислые палочки.
В России чистые культуры молочнокислых бактерий стали применять с 1890 г. Большой вклад в разработку способов приготовления чистых культур, сохранения их в сухом виде и использования к производстве кисломолочных продуктов внёс С.А. Северин.
И.И. Мечников, занимаясь проблемой старости у людей, считал, что молочная кислота и другие продукты обмена молочнокислых бактерий, содержащиеся в простоквашах, подавляют гнилостную микрофлору кишечника и предотвращают преждевременное старение организма.
Однако многочисленные опыты, проведённые позже И.И. Мечниковым, показали, что болгарская палочка, вводимая в организм с простоквашей, не обладает специфической способностью приживляться в кишечнике и исчезает из него вскоре после того, как прекращается пребывание в нём простокваши.
По данным американских учёных (Н. Копелов, Ф. Бирмарк, Л. Кальп, Л. Ретжер, В. Альбус), эта способность в гораздо большей cтепени присуща ацидофильной палочке, как естественному предcтавителю молочнокислых бактерий в нормальном кишечном биоценозе. По природе Lactobacterium acidophilum идентична болгарской палочке, но она уже адаптирована к условиям жизни в кишечнике.
Наряду с молочной кислотой многие кисломолочные продукты содержат специфические антибиотические вещества, подавляющие вредную микрофлору кишечника, в том числе и возбудителя туберкулёза.
Кисломолочные продукты широко применяются как для лечебного питания, так и для лечения людей и животных при ряде заболеваний. Так, кумыс, ацидофильно-дрожжевое молоко применяются при лечении туберкулёза, а ацидофильное молоко, простокваша, ацидофильная паста - как лечебно-диетические продукты при колитах, дизентерии, диспепсии у людей. Эти же кисломолочные продукты могут быть использованы и для лечения животных, особенно молодняка, при различных желудочно-кишечных заболеваниях.
Кроме того, для лечения молодняка животных при кишечных расстройствах применяются чистые ацидофильно-бульонные культуры (АБК), биобактон, лактобактерин. ацидофилин и другие чистые культуры молочно-кислых бактерий (табл. 15).
Таблица 15.
Метаболиты молочнокислых бактерий и их регуляторные функции
Механизм действия | Биологический эффект |
Молочная кислота | |
Синергизм сочетания с уксусной, пропионовой, масляной кислотами. Синтез внутри- и внеклеточного лактоферрина | Ингибиция роста условно- патогенных микроорганизмов. Снижение синтеза токсинов у плесневых грибов корма. Ингибиция роста железозависимых бактерий. |
Углекислый газ | |
Поддержание анаэробных условий и высокого пар- циального давления. Акцептор водорода при биосинтезе ацетата из гексозы | Снижение дыхательного потенциала у аэробных кишечных бактерий. |
Перекись водорода | |
Способствует образованию гипотиоцината в бактериаль- ных клетках. Повышение лактопероксидазной активности молока и | Токсическое действие на каталазо- положительную микрофлору. Повышению активности колост- |
молозива. Истощение ферментной системы у каталазозависящих микрорганизмов. Инактивация клеточных энзимов. | рального иммунитета. Снижение синтеза белков, ограни- чение передачи генетической ин- формации, снижение факторов ад- гезии у грамотрицательных бакте-рий. |
Лизоцим | |
Связывание антилизоцимного фактора у энтеропатоген- ных бактерий. Разрушение межклеточных связей у грамотрицательных микроорганизмов. Лизис клеточных стенок грамположительных бактерий. | Повышение фагоцитарной актив- ности макрофагов. Снижение колонизационной актив- ности у грамотрицательных бактерий. Неспецифическая стимуляция мак- рофагального иммунитета. |
Бактериоцины | |
Ограничение синтеза белков. Нарушение процессов транспорта через клеточную мембрану, снижение синтеза ДНК, уплотнение ядерного материала, изменение рибосом и лизосом. | Бактерицидное и бактериостатиче- ское действие. Сдерживание процессов деления бактерийных клеток, нарушение передачи наследственной инфор- мации. Деструкция рецепторных связей. Противоопухолевый эффект. |
Особенно важным является применение молочнокислых бактерий на фоне интенсивного лечения людей и животных антибиотиками. Как известно, антибиотики в большинстве своём не имеют избирательного действия на микроорганизмы. Наряду с возбудителями болезней они вызывают гибель нормальной микрофлоры кишечника. В ряде случаев это приводит к дисбактериозам, а иногда и к заболеваниям типа кандидомикоза и других. Применение же молочнокислых бактерий даёт возможность восстановить нормальную микрофлору кишечника.
|
|
В настоящее время установлено, что наряду с молочной кислотой, молочнокислые бактерии способны продуцировать антибиотические вещества (бактериоцины), подавляющие рост гнилостных, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Так, S. lactis образуют антибиотик низин, S. cremoris - диплококкцин, L. plantarum - лактолин, L. acidophilum продуцирует антибиотические вещества, подавляющие рост возбудителей дизентирии, брюшного тифа, сальмонеллёза, колибактериоза.
Кроме того, следует знать, что молочнокислые бактерии в процессе размножения образуют ещё и ароматические соединения, придающие продукту приятный вкус и ароматичность (диацетил и ацетальдегид), синтезируют жирорастворимые витамины А, Д, Е, богаты солями кальция, фосфора, магния.
С помощью своих экзоферментов молочнокислые бактерии расщепляют молочный белок с образованием ароматических незаменимых аминокислот - тирозина и триптофана и цистеин.
|
|
Продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожения (кумыс, кефир, айран, чал) содержат молочную кислоту, углекислоту, следы спирта (до 0,4-0,6%), которые вызывают сильное сокоотделение пищеварительными железами, что улучшает процесс пищеварения и усвоения человеком пищи или корма животными.
Селекция молочнокислых бактерий. Сырое молоко и молочные продукты издавна используются как источники выделения молочнокислых бактерий. Но молоко не является первоисточником этих бактерий.
Молочнокислые бактерии постоянно встречаются в почве, на растениях (цветах, листьях, стеблях, корневой системе). Чаще они сосредотачиваются в прикорневой зоне растений, а затем поднимаются на их надземную часть.
Впервые молочнокислые бактерии из природных источников растительного происхождения выделил и изучил их свойства В.М. Богданов(1959). Это послужило началом широкого использования отдельных растений для получения производственно-полезных штаммов молочнокислых бактерий.
Питательные среды для молочнокислых бактерий и технология их получения. Для селекции молочнокислых бактерий очень является правильный выбор питательных сред и условий культивирования. Чаще всего для выделения молочнокислых бактерий из природных источников используют стерильное обезжиренное молоко.
При культивировании гетероферментативных молочнокислых бактерий, для которых характерно сбраживание солей лимонной кислоты, в питательные среды добавляются лимоннокислый натрий (1%), а в отдельных случаях и дрожжевой гидролизат (2%). На таких же средах осуществляют культивирование молочнокислых бактерий с целью получения заквасок для производства различных молочнокислых продуктов - творога, сметаны, йогурта, простокваши и др.
Кроме обезжиренного молока, для культивирования молочнокислых бактерий в промышленных условиях с целью получения пробиотиков, применяют гидролизованное молоко. Для этого обезжиренное молоко стерилизуют при температуре 120 °С в течение 10-15 мин и охлаждают до 45°С. Обезжиренное молоко должно иметь слегка кремоватый цвет. Затем устанавливают рН до 7,6 - 7,8 и к обезжиренному молоку добавляют из расчёта на 1 литр 0,5-1 г панкреатита или 2 - 3 г поджелудочной железы. Через несколько минут в молоко добавляют хлороформ из расчёта 5 мл на 1 л. Такую смесь в бутылях, закрытых резиновой пробкой, выдерживают в термостате при 40°С в течение 24ч. В первые часы молоко следует периодически перемешивать. Через 24 ч гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. Такой гидролизат обычно прозрачный, реакция его нейтральная и слабокислая, содержит 110 -120 мг% аминного азота, срок хранения 1-2 недели.
Для приготовления из гидролизата молока питательной среды его разводят деминерализованной водой в отношении 1:1 - 1:2 и устанавливают рН = 6,8 - 7,0. При необходимости вводят различные добавки. Питательную среду стерилизуют при 110° С в течение 30 мин. Это делается для предотвращения образования в среде белково-сахарных комплексов, отрицательно влияющих на рост молочнокислых бактерий.
Технология изготовления биобактона. Биобактон представляет собой лифилизированную культуру ацидофильной палочки, обладающей высокими антибиотическими и кислотообразующими свойствами. Для его приготовления используют обезжиренное молоко или среду на основе гидролизата молока по описанному выше методу. Культивируют L.acidophilum при 37 °С в течение
10-15ч. При этом в процессе культивирования среду периодически нейтрализуют кальцинированной содой, что обеспечивает накопление микробных клеток до 3 млрд/мл (этот процесс автоматизирован). Отделяют микробные клетки ацидофильных бактерий в стационарную фазу, т.е. через 10 - 15 ч культивирования. В этот период микробные клетки являются более активными и стойкими к замораживанию.
Бактериальную массу концентрируют на суперцентрифугах (сепараторах) производительностью 200 - 800 л/ч, работающих при частоте вращения ротора 16000об/мин. Полученный концентрат ацидрфильной палочки обычно содержит 250-300 млрд клеток в 1 г.
Чаще всего биобактон выпускают в лиофильно высушенном виде. В качестве среды высушивания используют молочный обрат с сахаром или сахарозо-желатиновую среду.
Концентрированную биомассу разбавляют средой высушивания 1:6, расфасовывают по флаконам, а затем подвергают лиофильной сушке. После этого флаконы закрывают резиновыми пробками, обкатывают для герметичности алюминиевыми колпачками. Проводят контроль на стерильность, биологическую концентрацию бактерий (количество живых микроорганизмов), антагонистическую активность, влажность и др.
Технология изготовления лактобактерина. Лактобактерин - это пробиотик, выпускаемый отечественной промышленностью. В состав лактобактерина для животных входят 2 вида лактобактерий – L.plantarum и L.fermenti.
Технология производства лактобактерина во многом аналогична биобактану (рис.7).
Приготовление питательной среды |
Подготовка посевного материала |
Культивирование микроорганизмов (2 сут.) |
Выделение и концентрирование лактобактерий |
Лиофильное высушивание |
Придание готовой лекарственной формы |
Фасовка, упаковка, этикетирование |
Контроль готовой продукции |
Рис.7. Схема производства лактобактерина
Контроль качества лактобактерина проводят по таким показателям, как биологическая концентрация, отсутствие посторонней микрофлоры, антагонистическая активность.